Zawartość
- etapy
- Metoda 1 Zidentyfikuj bakterię za pomocą barwienia metodą Grama
- Metoda 2 Wykonaj test barwienia Ziehla-Neelsena
- Metoda 3 Badanie zachowania i wyglądu bakterii
- Metoda 4 Zinterpretuj wszystkie wyniki
Identyfikacja bakterii jest złożonym zadaniem. Jednym z powodów jest to, że według szacunków na świecie istnieje od 10 000 do 1 miliarda gatunków bakterii! Prawidłowe zidentyfikowanie bakterii jest bardzo ważne, szczególnie w medycynie, gdzie właściwe leczenie choroby zależy w dużej mierze od rodzaju drobnoustroju, który powoduje problem. W większości przypadków identyfikacja odbywa się na podstawie eliminacji. Aby zidentyfikować bakterię, musisz wykonać testy barwienia, przeanalizować jej wygląd i obserwować, jak dobrze reaguje na różne warunki. Jeśli potrzebujesz szybkiego wyniku, pobierz próbkę DNA, aby wysłać ją do laboratorium.
etapy
Metoda 1 Zidentyfikuj bakterię za pomocą barwienia metodą Grama
- ustalać jeśli bakterie są Gram-dodatnie lub ujemne. Barwienie metodą Grama jest metodą podziału bakterii na dwa najczęściej występujące typy: Gram-dodatnie i Gram-ujemne. Te pierwsze mają grubą ścianę komórkową składającą się z polimeru zwanego peptydoglikanem, który ma najlepsze zabarwienie jako cienkie ściany bakterii Gram-ujemnych.
- Niektóre popularne typy bakterii Gram-dodatnich to paciorkowce, gronkowce, mikrokoki (lub mikrokoki) i listeria.
- Oto kilka typowych przykładów bakterii Gram-ujemnych: Neisseria, Acinetobacter, Moraxella, Enterobacteriaceae, Vibrio, Haemophilus, Fusobacterium i Campylobacter.
- Podejmij odpowiednie środki ochronne. Bakterie i pierwiastki chemiczne, których użyjesz podczas testu, stanowią zagrożenie dla zdrowia. Podczas wykonywania testu barwienia należy nosić okulary ochronne, jednorazowe rękawiczki nitrylowe i fartuch laboratoryjny. Po zakończeniu włóż rękawiczki i wszystkie inne zanieczyszczone materiały do specjalnej torby. Pamiętaj, aby postępować zgodnie z procedurami laboratoryjnymi, aby pozbyć się worka na zanieczyszczone produkty.
- Umieść próbkę do obserwacji na szklanym szkiełku. Aby rozpocząć test, umieść kroplę lub próbkę bakteryjną na sterylnym szkiełku. Następnie przesuń ostrze nad zapalonym palnikiem Bunsena trzykrotnie, aby naprawić próbkę i zapobiec wypadnięciu jej z płytki podczas płukania lub dodawania odczynników.
- Dodaj 5 kropli fioletowego kryształu do ostrza. Wlej pięć kropli roztworu fioletu krystalicznego do próbki. Poczekaj minutę, aż próbka wchłonie krystaliczny fiolet.
- Trzymaj ostrze w miejscu za pomocą szpilek do ubrania, aby nie poplamić rąk.
- Dokładnie umyj ostrze, aby usunąć plamę. Użyj kranu lub ściśnij butelkę i pozwól wodzie płynąć bardzo powoli przez maksymalnie pięć sekund, aby usunąć pozostałości atramentu, które nie przylgnęły do próbki.
- Wlać pięć kropli bejcy diodowej Gram na szkiełko. Jest to roztwór składający się z diody, wodorowęglanu sodu i diodku potasu, który powoduje, że fiolet krystaliczny topi się ze ścianami komórkowymi bakterii. Wlej pięć kropli roztworu do próbki i pozostaw na jedną minutę.
- Umyj próbkę alkoholem lub kwasem mlekowym. Alkohol i laketon są środkami wybielającymi i wyeliminują przebarwienia ścian komórek bakteryjnych, jeśli są Gram-ujemne. Wlej kilka kropli wybielacza na próbkę i pozwól mu działać przez nie więcej niż trzy sekundy. Następnie spróbuj delikatnie płukać wodą przez pięć sekund, aby usunąć te wybielacze.
- Jeśli pozwolisz wybielaczowi działać przez długi czas, może to spowodować zanik barwienia bakterii Gram-dodatnich, powodując fałszywie ujemny wynik.
- Wykonaj test kontrastu z safraniną. Safranina to czerwony barwnik, który kontrastuje z fioletem krystalicznym, zabarwiając bakterie bez fioletowego zabarwienia. Wlać około pięciu kropli safraniny do próbki i pozostawić na jedną minutę. Następnie spróbuj delikatnie płukać wodą przez pięć sekund.
- Wizualizuj swoją próbkę przy powiększeniu 1000X. Bakterie staną się fioletowe lub fioletowe, jeśli są Gram-dodatnie, lub różowe, jeśli są Gram-ujemne z powodu safraniny.
Metoda 2 Wykonaj test barwienia Ziehla-Neelsena
- Użyj tej techniki do wykrywania bakterii kwasoodpornych. Gatunki te zawierają większą ilość lipidów, dzięki czemu są bardziej odporne na barwniki stosowane w barwieniu metodą Grama. Bakterie kwasoodporne należą do rodzaju Mycobacterium, w tym bakterii odpowiedzialnej za gruźlicę (M. tuberculosis). Aby zabarwić bakterię kwasoodporną, należy użyć czerwonego barwnika zwanego karbolową fuksyną, odpornego na płukanie roztworami kwasu lub siarkowego.
- Podejmij odpowiednie środki ochronne. Materiały chemiczne i biologiczne stosowane podczas barwienia Ziehla-Neelsena mogą być niebezpieczne. Ponadto będziesz musiał użyć źródeł ciepła, takich jak dysza Bunsena, grzejnik elektryczny lub lampa alkoholowa. Wykonaj poniższe instrukcje, aby wykonać test.
- Załóż okulary, rękawice nitrylowe i fartuch laboratoryjny.
- Uważaj, aby nie wdychać oparów barwników i wybielaczy i nie pozwól, aby krople rozpryskiwały się na twoich oczach lub skórze. Trzymaj pojemniki otwarte pod maską.
- Zachowaj szczególną ostrożność podczas podgrzewania ostrza. Większość używanych chemikaliów jest łatwopalna. Na szkiełkach lub innym sprzęcie mogą znajdować się również ślady łatwopalnych substancji.
- Przygotuj ostrze. Okrągłymi ruchami równomiernie rozprowadź niewielką ilość próbki bakteryjnej pośrodku sterylnego szkiełka. Twoja próbka powinna zajmować około 10 mm na 20 mm.
- Osusz ostrze. Umieść ostrze na strukturze suszącej preparatem skierowanym do góry. Niech wyschnie naturalnie przez 30 sekund. Nie próbuj suszyć ostrza szmatką.
- Zabezpiecz próbkę za pomocą ciepła. Podnosząc preparat, przesuń ostrze dwa lub trzy razy nad zapalonym palnikiem Bunsena. Możesz także umieścić ostrze na grzejniku elektrycznym, ustawiając temperaturę między 65 ° C a 75 ° C na co najmniej dwie godziny. Uważaj, aby nie zagotować ani nie spalić próbki.
- Dodaj karboliczną fuksynę do ostrza. Wlać kilka kropli tego roztworu na szkiełko. Wlać tyle, aby całkowicie zakryć próbkę.
- Podgrzej ostrze, aby naprawić barwnik. Ostrożnie ogrzej szkiełko nad palnikiem Bunsena lub lampą alkoholową, próbką skierowaną do góry, lub umieść go na grzejniku elektrycznym. Podgrzej ostrze do 60 ° C lub do momentu, gdy zacznie wypuszczać parę. Pozwól barwnikowi działać przez pięć minut.
- Jeśli używasz grzejnika elektrycznego, włącz go w temperaturze 60 ° C. Jeśli zdecydujesz się na lampę alkoholową lub palnik Bunsena, powinieneś spodziewać się oparów.
- Aby utrzymać ostrze w pożądanej temperaturze przez pięć minut, przerywaj go.
- Uważaj, aby nie zagotować, nie spalić ani nie osuszyć próbki.
- Opłucz ostrze zimną wodą. Niech ostygnie przez pięć minut i delikatnie spłucz przez kilka sekund czystą wodą. Użyj wody z kranu lub ściśnij butelkę, aby usunąć plamy barwnika, które nie przylgnęły do próbki.
- Wlać próbkę kwaśnego alkoholu lub kwasu siarkowego. Użyj objętości 3% objętościowo (v / v) alkoholu lub 20% kwasu siarkowego, aby całkowicie zakryć próbkę. Pozwól kwasowi pracować, aż kolor zniknie i osiągnie bardzo jasny różowy odcień. Proces zwykle trwa około dziesięciu minut.
- Użyj czystej wody, aby przepłukać ostrze. Delikatnie umyj ostrze pod bieżącą wodą lub za pomocą butelki do wyciskania. Dobrze usuń wszystkie pozostałości kwasu i barwnika.
- Dodaj środek kontrastowy. Po przepłukaniu szkiełka nałóż barwnik malachitowy zielony lub błękit metylenowy. Te dwa rozwiązania tworzą niebieskawe lub zielonkawe tło, na którym pojawi się czerwony barwnik, a także inne materiały biologiczne, takie jak komórki ludzkie i bakterie niewrażliwe na działanie kwasów. Pozwól substancjom działać przez jedną do dwóch minut.
- Opłucz i wysusz ostrze. Dokładnie spłucz wodą, aby usunąć nadmiar kontrastu. Po zakończeniu osusz tył ostrza suchą szmatką i pozwól mu wyschnąć naturalnie na stojaku.
- Wizualizuj swoją próbkę przy powiększeniu 1000X. Bakterie kwasoodporne zmienią kolor na czerwony lub ciemnoróżowy. Inne bakterie, komórki niebakteryjne i podstawa ostrza zmieni kolor na zielony lub niebieski.
Metoda 3 Badanie zachowania i wyglądu bakterii
- Przeanalizuj kształt bakterii. Po przeprowadzeniu testu barwienia w celu ustalenia, czy bakterie są Gram-dodatnie, Gram-ujemne lub kwasoodporne, nadszedł czas na dokładniejszą identyfikację gatunku. Najpierw przeanalizuj kształt bakterii na szkiełku. Trzy najczęstsze formy to cocci (sferyczne), spirale i pałeczki (kształt pręta).
- Istnieje kilka wariantów tych form. Na przykład bakterie o okrągłym kształcie (coccus) mogą występować w parach (diplococci), w łańcuchach, w hałdach lub w grupach po cztery (tetrad).
- Dowiedz się, czy bakteria jest tlenowa lub beztlenowa. Pobierz dwie próbki bakterii i utwórz dwie osobne kultury. Księżyc musi być beztlenowy (rośnie bez tlenu), podczas gdy drugi musi być tlenowy (rośnie z tlenem). Przechowuj kulturę beztlenową w temperaturze 35 ° C w miejscu beztlenowym przez co najmniej 48 godzin przed obserwowaniem wzrostu.
- Jeśli bakterie rosną w środowisku bez tlenu, ale nie pod wpływem tlenu, oznacza to, że są beztlenowe.
- Chociaż rozwijają się w środowisku natlenionym, ale nie pod nieobecność tlenu, są tlenowe.
- Gdy rozwijają się w obu środowiskach, mówimy o fakultatywnych bakteriach beztlenowych.
- Wykonaj test motoryki. Bakteria jest mobilna, jeśli może poruszać się sama z jedną lub więcej wici. Stopień ruchliwości jest bardzo ważny przy identyfikacji niektórych gatunków bakterii. Istnieje kilka rodzajów ruchliwości, ale najbezpieczniejszym i najbardziej czytelnym sposobem jest półstałe medium.
- Utwórz kulturę dla testu ruchliwości. Przygotuj kulturę bakterii w bulionie hodowlanym. Postępuj zgodnie z instrukcjami poniżej, aby przygotować wybrany bulion.
- Zaszczepić kulturę półstałym agarem do testów ruchliwości. Pokryj część kultury bulionu sterylną igłą do zaszczepiania. Ostrożnie umieść igłę w półstałej probówce z dagarem, takiej jak lagar TTC, którą przygotowałeś do testu. Igła musi penetrować 2/3 agaru.
- Po zakończeniu ostrożnie wyjmij igłę, uważając, aby nie przekroczyć granic strefy zaszczepienia.
- Inkubować probówkę w 30 ° C przez 48 godzin.
- Przeczytaj wynik testu. Agar do testu ruchliwości zmieni kolor na czerwony w kontakcie z bakteriami. Jeśli są ruchome, ten czerwony lub różowawy odcień rozprzestrzeni się w całej substancji. W przeciwnym razie zabarwienie będzie ograniczone do miejsca wstrzyknięcia.
Metoda 4 Zinterpretuj wszystkie wyniki
- Zbierz swoje komentarze. Aby poznać rodzaj bakterii, konieczne będzie zebranie informacji uzyskanych z kultur, testów barwienia i obserwacji form. Jeśli badasz próbki pacjenta, objawy, które one przedstawiają, mogą również pomóc w określeniu odpowiedniego rodzaju bakterii.
- Na przykład, jeśli testy wykażą, że bakterie są Gram-ujemne, beztlenowe, nieruchliwe, a pacjent zauważy objawy takie jak ból brzucha, nudności i wymioty u pacjenta, prawdopodobne jest, że pacjent cierpi na infekcję Bacteroides. fragilis.
- Sprawdź bazę danych. Na świecie istnieją tysiące gatunków bakterii. Nie da się wszystkiego wiedzieć na pamięć. Najprawdopodobniej będziesz musiał zajrzeć do książki mikrobiologii klinicznej lub internetowej bazy danych, aby porównać wyniki testu z informacjami na temat gatunków bakterii.
- Istnieją doskonałe zasoby internetowe do identyfikacji bakterii, ale większość tych baz danych jest dostępna w języku angielskim, w tym Patricbrc.org i GlobalRPh. Przydatne informacje można jednak znaleźć na stronie internetowej Międzynarodowego Centrum Zasobów Mikrobiologicznych INRA.
- Wykonaj test genetyczny, aby poznać dokładny gatunek bakterii. W niektórych przypadkach może być konieczne zidentyfikowanie gatunku bakterii. Najszybszą i najłatwiejszą metodą jest wykonanie testu DNA. Testy DNA są również przydatne do identyfikacji bakterii odpornych na tradycyjne formy barwienia i hodowli. Obecnie testy DNA na mikroorganizmach są bardzo szybkie i mogą być gotowe w mniej niż dwie godziny.
- Jeśli nie masz dostępu do laboratorium, które wykonuje sekwencjonowanie genetyczne mikroorganizmów, wyślij próbkę bakterii do specjalistycznej agencji.